Осп окраска: выбираем лучший вариант для отделочных

13.07.197708.10.2022 alexxlab 0 Комментариев

Содержание

Окрашенный ОСБ лист и оригинальные варианты применения

2020 год в мире дизайна интерьеров объявлен годом экологичности и единения с природой. В связи с этим в обстановке офисов и домов преобладает дерево и камень. Экологичность подразумевает использование альтернативных натуральной древесине материалов. Одним из лидеров таких материалов является плита ОСБ (OSB, она же ОСП).

ОСБ плита (ориентированно стружечная плита) – многослойный лист, который состоит из крупной стружки хвойных пород деревьев. Благодаря тому, что щепы в каждом слое имеют определенное направление (внешние слои — продольное, внутренние — поперечное), прочность плит ОСБ выше, чем у других пиломатериалов.

Преимущества применения осб в интерьере

Стоит отметить, что отделка стен из осб придает любому помещению стиль гранж. Такой стиль является идеальным сочетанием простоты, респектабельности и уюта. Давайте детальнее рассмотрим, какие преимущества дает применение осб плит.

Экологичность

Изготовление ориентированно стружечных плит от Kronospan происходит в соответствии с европейскими стандартами санитарно-эпидемиологических норм EN300. Контроль качества осуществляется на всех этапах производства.

Проверка на содержание формальдегида происходит перфораторным методом, в соответствии с ГОСТ 27678-2014 (EN120). Норма содержания формальдегида для пиломатериалов по европейскому стандарту Е1. Это говорит о высоком уровне экологичности этого стройматериала.

Простота в обработке

Плиты легко пилятся и сверлятся. Благодаря технологии изготовления, во время обработки не трескаются и не расслаиваются. Коэффициент удержания креплений на 25 % выше, чем у фанеры и ДСП.

Плиты легко красятся любыми красками для дерева, покрываются лаком или морилкой.

Устойчивость к температурным перепадам и влажности

Осб плиты можно монтировать как в вертикальном, так и в горизонтальном положении вплотную друг к другу с минимальным зазором (

3мм), и не бояться, что они начнут деформироваться.

Прочность и плотность

Плотность плиты составляет 600-650 кг/м3. Прочность плит определяется по нескольким параметрам:

Прочность на изгибе от 22/11 до 20/10 МПа, в зависимости от толщины плиты ОСБ 3;
Прочность при растяжении поперек пластины от 0,30 до 0,34 МПа;
Прочность при изгибе от 7 до 9 Мпа;
Модуль упругости 3500/1400 Мпа.

Эти показатели говорят о том, что физико-механические качества плит осб в 2,5 раза выше чем у плит из фанеры и ДСП.

Низкий уровень дефектов

Одним из финальных этапов производства осб плит является шлифовка. Это исключает наличие сучков, или неровностей по всей поверхности плиты.

Все эти параметры говорят в пользу того, что отделка стен из ОСБ долговечна и безопасна для здоровья.

Окрашивать осб или сохранить оригинальную текстуру

Сегодня вы можете покрасить стены из осб с помощью матовых или глянцевых красок. Можно покрыть только лаком или использовать морилку. Все варианты декорирования будут зависеть от общего интерьера.

Если вы предпочитаете стиль лофт, следует сохранить оригинальную текстуру и оттенок плиты. Покрытие стен лаком также понравится любителям гранж.

Перед обработкой плит любым из этих покрытий, поверхность следует обработать шкуркой 120. Затем кисточкой убрать всю пыль, чтобы плита смотрелась аккуратно под покрытием. Что касается обработки швов, используйте акриловый герметик. Поверхность плит грунтуется перед нанесением любого покрытия.

Существует огромное количество морилок. Вы можете придать плите любой оттенок. Особенностью такого покрытия является акцентирование на необычной текстуре плит. Дополнительное покрытие плиты лаком придаст глянцевый блеск вашим стенам.

Покраска плит в определенный цвет создает элегантный антураж, в сочетании с меблировкой. Вы можете создавать свой уникальный стиль и зонировать свободное пространство используя разные цвета и оттенки.

Способы покраски ОСБ

И покраска, и покрытие лаком, и морилкой выгодно смотреться в любом интерьере. Если вы предпочитаете вид натуральной фактуры ОСБ, но хотите придать определенный оттенок, используйте лессирующие лазури. Это тонкие краски на основе акрила, которые создают прозрачную пленку на поверхности плиты и сохраняют текстуру. А лазурь с эффектом металлик создаст эффект мерцания стен.

ВАЖНО! Также существуют лессирующие лазури на алкидной основе. Они подходят только для отделки фасадов.

Окраска осб непрозрачными красками сохраняет рельефность поверхности, если плиты предварительно не шпаклевать. Такой способ обработки сэкономит время работы. Краски для ОСБ плит внутри помещений должны быть безопасными для здоровья. Выбирайте масляные краски для древесины. Благодаря олифе впитываемость таких красок минимальна.

Оригинальные варианты дизайнов

Согласно трендам, окрашенный осб в интерьере всегда выглядит оригинально. С помощью сочетаний разных материалов и видов отделки, вы можете создавать выгодные контрасты.

Для любителей смелых решений, рекомендуем точечное окрашивание плит. Этот способ интересно смотрится в офисном помещении. Например, логотип вашей фирмы или предприятия имеет определенные цвета (черный, голубой, белый). Покраска отдельных щеп плиты в отдельные цвета создаст эффект индивидуальности.

С помощью краски вы можете создавать различные рисунки. Сочетание строгих геометрических линий черного цвета и оригинального оттенка плиты осб прекрасно впишется в интерьер как офисных помещений, так и жилых. С таким рисунком хорошо сочетается мебель белого, серого и черного цвета со стальными или хромированными элементами.

Оригинально смотрится мозаика из отдельных кусочков осб плиты. Даже если просто покрыть ее лаком, благодаря узорам щеп создается красивый рисунок. Для создания оригинальности, каждая плитка мозаики также может быть окрашена в нужный цвет.

Следует отметить, что правильно подобранное освещение поможет по достоинству оценить оригинальность интерьера.

Для жилых помещений с маленьким пространством, удачным решением будет сочетание светлых оттенков, это визуально увеличит пространство и придаст ощущение уюта.

Детская комната требует максимального пространства для игр. Стены из осб можно дополнительно оснастить полками для вещей. А если каждую полочку покрасить в разный цвет, комната будет выглядеть ярко и интересно.

Покрытые лаком или морилкой стены из осб в сочетании с мебелью из того же материала создадут ощущение единения с природой. В такой интерьер можно добавить популярные сегодня мхи в бетонных горшочках и вьющиеся растения. Такой стиль в условиях города дает возможность расслабиться.

В интерьере можно использовать осб не только для отделки стен, но и создавать элементы декора, делать перегородки и мебель. Если говорить о большом пространстве, шкаф-перегородка прекрасно впишется таком помещении. Стеллажи из осб разной ширины создадут эффект объемности стены, и создадут дополнительное пространство для хранения нужных вам вещей или элементов декора.

В большом офисном помещении небольшие перегородки из осб разделят рабочее пространство. Такое решение создаст для ваших сотрудников ощущение уюта и комфорта.

Осб плиты благодаря своей структуре и техническим характеристикам, прекрасно справляются с задачами дизайнеров и строителей. Отделка стен из осб создаст дополнительную теплоизоляцию. Это свойство поможет сохранить тепло в ваших домах.

Окраска OSB | К-ДОМ

Одним из самых востребованных материалов в строительстве быстровозводимых зданий считаются плиты ОСП. Так, в каркасном домостроении плиты ОСП играют важнейшую роль, одновременно скрепляя каркасные блоки и защищая утеплитель от внешних воздействий. В то же время окраска ОСП может служить и финишной отделкой, как фасада зданий, так и внутренних стен.

Содержание

1. ОСП-плиты как структурный элемент каркаса и как покрытие
2. Виды ОСП
3. Защита стен дома от внешних факторов
4. Виды лакокрасочных материалов для окраски ОСП
5. Этапы окраски и их особенности
6. Заключение

1. ОСП-плиты как структурный элемент каркаса и как покрытие

ОСП – это ориентировонно-стружечная плита. Другое распространенное название – OSB, производное от английского (oriented strand board), а в русском варианте – ОСБ.

Такой материал, как ОСП, появился в строительной индустрии сравнительно недавно и с успехом заменил традиционную фанеру и листы ДВП, используемые раньше в качестве различных покрытий. Не уступая фанере по прочности, листы ОСП имеют большую толщину при меньшем удельном весе. А структура ОСП значительно прочнее структуры ДСП (древесно-стружечных плит) за счет своей структуры и также выигрывают в легкости при равных габаритах листов.

Структура ОСП состоит их длинных тонких волокон, которые укладываются в несколько перпендикулярных слоев, пропитываются специальным связующим и упрочняются при высоком давлении. В основе связующего – водоотталкивающие смолы. Подбор связующего осуществляется не только чтобы создать упрочненную структуру плиты, но и для максимальной защиты ее от внешних воздействий.

Структура ОСП

2. Виды ОСП

ОСП производят в нескольких вариантах – в зависимости от назначения плит. Основные типы ОСП классифицируют по их водоотталкивающим свойствам:

ОСП 1 – для отделки внутренних стен, при низкой влажности помещения
ОСП 2 – для помещений с обычной влажностью
ОСП 3 – для помещений с повышенной влажностью и перекрытий, куда может просочиться влага
ОСП 4 – для внешней отделки фасада, подвергающейся осадкам и повышенной влажности из атмосферы

Листы ОСП при толщине от 9 до 12 мм имеют габариты от 1250х2500 до 1250х2800 мм, что удобно для их внешней отделки, так как на большой площади сохраняется ровная поверхность, а количество стыков относительно всей площади стены минимально.

3. Защита стен дома от внешних факторов

Листы ОСП служат не только покрытиями но и элементами каркаса, защищая утеплитель от внешних воздействий и скрепляя каркасную ячейку.

С внешней стороны дома на каркас оказывают влияние:

Действия ветра, разрушающего утеплитель
Механические воздействия (случайные повреждения от удара, сколов и т.д)
Действия ультрафиолета солнечных лучей
Влажность воздуха и прямое попадание воды от дождя и снега
Химические летучие соединений, содержащиеся в воздухе

Будучи защитой каркаса от внешних воздействий, сама ОСП тоже со временем склонна к разрушению и требует дополнительных мер по защите своей поверхности.

К тому же внешний вид ОСП, хоть и имеет некоторую декоративную привлекательность – но использовать его как финишную отделку фасадных и иных поверхностей, конечно, не стоит.

Для защиты поверхности ОСП и придания фасаду более привлекательного вида используют различные виды внешней отделки. Понятно, что фасад жилого дома желательно защитить и украсить внешней облицовкой. Существует много замечательных облицовочных технологий, о чем мы подробно писали на нашем сайте (см.

здесь).

В ряде случаев – в основном для отделки неответственных зданий или для отделки внутренних стен – используется такой способ как простая окраска ОСП.

Покраска фасада из ОСП

4. Виды лакокрасочных материалов для окраски ОСП

Малярные работы по ОСП не так просты, как окраска многих других покрытий. Сама структура волокон и наличие в составе ОСП водоотталкивающих смол в некотором роде противостоят равномерному и ровному их окрашиванию. Поверхность ОСП шероховатая, а связующее сочетается не с каждым лакокрасочным материалом (ЛКМ), поэтому для окраски их следует применять только определенные технологии.

Существует несколько наиболее распространенных видов ЛКМ, применяемых в наружных и внутренних работах, в том числе и по ОСП:

Масляные краски
Алкидные лаки и краски
Акриловые материалы
Прозрачные лаки

Масляные краски состоят из природных и искусственных пигментов, связанных олифой. Они традиционно широко используются для окраски деревянных поверхностей, так как олифа имеет хорошую адгезию к древесине. Пленки высохшей краски на основе олифы достаточно прочны и не пропускают влагу. Они достаточно долго сохраняют свои защитные свойства.

В то же время масляные краски имеют повышенную токсичность, долго сохнут и недостаточно хорошо сопротивляются ультрафиолетовому излучению. Недаром картины художников требуют специальных условий хранения и экспозиции.

Но самое главное – краски на основе олифы имеют недостаточно хорошую адгезию к поверхности ОСП в связи с особенностью используемых в их структуре связующего.

Говоря проще, масляная краска плохо ложится на ОСП.

Алкидные краски основаны на алкидной смоле, которая имеет хорошую адгезию к связующему ОСП. Алкидная пленка также лучше сопротивляется пагубному влиянию ультрафиолета и химических соединений в воздухе по сравнению с высохшей пленкой олифы.

Акриловые краски производят на водной основе. В связи с этим они нетоксичны и наиболее дешевы. Но их применение при окраске ОСП (особенно с внешней стороны дома) нежелательно из-за того, что вода приводит к расслоению, набуханию плит и их деформации.

Хорошие результаты по окраске ОСП показывают бесцветные лаки на органической основе. Они хорошо связываются с поверхностью ОСП. Лаковая пленка достаточно прочна и хорошо противодействует внешним воздействиям. Единственный минус – они прозрачны и не сильно изменяют внешний вид поверхностей, покрытых ОСП. Впрочем, в ряде случаев, этим даже пользуются дизайнеры – из-за необычной текстуры плит.

Отделка помещения лакированными ОСП

Подводя итоги, скажем, что наиболее распространенным вариантом для окрашивания ОСП считается все же использование алкидных красок.

5. Этапы окраски и их особенности

Поверхность ОСП имеют значительную шероховатость и требуют шлифовки – в первую очередь при создании декоративных финишных покрытий. Мелкие сколы, дефекты поверхности следует зашпаклевать – при этом используется шпаклевка на той же основе, что и ЛКМ.

Самым тщательным образом нужно обработать края ОСП, так как торцы – это их самое уязвимое место. Острые края следует скруглить и дополнительно отшлифовать, а места стыков ОСП заделать герметиком – тоже на основе используемого ЛКМ, например, алкидным.

Любую поверхность под окраску необходимо хорошо загрунтовать – то есть покрыть предварительно слоем, обеспечивающим наиболее высокую адгезию ЛКМ к поверхности плит.

В качестве грунтовки выбирают материалы, сочетающиеся с используемой краской.

Грунтовка внутренних стен из ОСП

Перед нанесением краски грунтовке нужно дать хорошо просохнуть. Требуемое время обычно указано на инструкции к тому или иному материалу.

В самой окраске ОСП с хорошо подготовленной поверхностью нет ничего особенно сложного. Красят поверхности стен либо широкой кистью, либо валиком. Впрочем, правильное нанесение краски требует некоторого опыта.

Качественная окраска ОСП валиком

Главное – избегать потеков, которые потом очень трудно будет исправить. Краску также нельзя наносить слишком толстым слоем, иначе она будет стекать под собственным весом, не успев просохнуть.

Лучше нанести несколько тонких слоев (это вообще оптимальный вариант), чем один толстый слой, который будет долго сохнуть и образует там и тут подтеки. Недопустимо наносить второй слой на предыдущий, если нижний слой недостаточно просох – это может привести к порче, почернению краски.

Хорошие результаты дает использование для окраски пульверизатора, то тут необходимо дорогостоящее оборудование.

6. Заключение

Окраска ОСП рассматривается обычно как бюджетный вариант финишной отделки. Даже при этом можно получить хороший результат, если строго подойти к выбору лакокрасочных материалов и подготовке поверхностей к работе.

Специалисты нашей фирмы «К-дом» помогут застройщикам в выборе оптимальных вариантов покраски дома, построенного под ключ, а также реставрации покрытий уже используемых домов.

ОСБ плиты: размеры, виды, характеристики

Виды ОСБ плит и сферы их применения
Характеристики ОСБ плит
Размеры ОСБ плит
Покраска ОСБ плит

Плиты ОСБ становятся с каждым днём всё более популярными. Что же такое ОСБ? Это ориентированно-стружечные плиты, которые делают с помощью стружки из дерева и опилок. Плиты очень прочные, гибкие, имеют отличные технологические характеристики. Их применяют в каркасных строительных работах для того, чтобы обшить стены, сделать кровлю или перегородки.

Выглядит данная плита как прессованное полотнище, которое создано из щепочек, стружек и различных опилок. Внимательно рассмотрев данное полотно, вы увидите, что оно включает в себе далеко не один слой. Слои, которые находятся снаружи, располагаются вдоль, а слои, которые находятся внутри – сделаны в другом направлении. Все слои отлично между собой проклеены с помощью различных смол, воска, пропитки, поэтому изделие само по себе очень прочное.

Мы рассмотрим, какие бывают плиты ОСБ, каким образом их применяют в строительстве, увидим все их достоинства, перечислим самые популярные виды плит.

Виды ОСБ плит и сферы их применения

Сегодня специалисты делают разновидности ОСБ в количестве четырёх видов. Отличие их в том, что они имеют разные характеристики, применяются в различных отраслях.

Плита ОСБ 1 – это плита из древесно-стружечного материала, которая имеет невысокую плотность. Такая плитка не любит влажности, поэтому с помощью неё, в основном, делают предметы мебели.
Плита ОСБ 2 – плотнее и прочнее предыдущей, однако тоже боится воды и влаги. То, что эти плиты по своей структуре очень плотные, делает возможным использование их во внутреннем обшивании объектов, которые являются несущими, при этом влажность должна быть невысокой.
Плита ОСБ 3 – является самой востребованной. Она очень прочная и устойчива к влажности. Однако стоит учесть, что под влажностью здесь подразумеваются лишь намокания на очень короткое время. Чтобы обделывать ней объект снаружи, нужно будет ещё вдобавок защитить этот лист дополнительными материалами, то есть покрасить или пропитать.
Плита ОСБ 4 – особо прочная, суперустойчива к влаге. Может долгое время находится во влажной среде, и дополнительно защищать её не требуется. Но такие плиты стоят довольно дорого, поэтому применяют её не так часто, как ОСБ 3.

Расход шпаклёвки на 1м2 — расход стартовой и финишной шпаклёвки

Расход грунтовки на 1м2: для чего нужна и нормы расхода

Так же листы плит проходят классификацию относительно своей толщины. Тоненькие плиты используются для обшивания предметов, которые не нагружают плиту. Например, стенки, каркас для мягкого покрытия, обшивка пола из дерева.

Толстую плиту используют для объектов с очень высокой нагрузкой на лист. Из них настилают пол, делаются конструкции, где по плану будут стоять тяжёлые материалы.

Характеристики ОСБ плит

ОСБ плиты начисляют в себе множество положительных характеристик, в связи с которыми они так часто применяются для строительных работ.

Характеристики ОСБ плит:

Очень прочные. Чем толще плита, тем больше нагрузки она выносит. Это может быть даже сто килограммов на один кв.м.
Гибкие и лёгкие. Эта характеристика разрешает применение плит для обшивания неровных поверхностей с высоким закруглением.
Однородные. Такие листы целостные, даже во время нагрузки. Не склонны к расслоению, в отличие от обыкновенной фанеры.
Качественные, как и натуральное дерево. Причём здесь нет минусов неровной формы, дефектности во время применения.
Легкие при обработке. Очень легко проходит распиливание, прикрепление, соединение таких материалов.
Имеют высокую теплоизоляцию и звукоизоляцию, сравнительно с прочими средствами.
Стойкие к воздействию химических материалов и повреждениям.
Антисептичны. В этих листах есть добавления, которые не дают размножаться грибковым и плесневым бактериям.
Неизменны в форме даже при долгом применении и после него.

Единственным минусом ОСБ является то, что в их состав часто входит клей с формальдегидом, а данное вещество вредно для здоровья. Но его используют не все производители.

Важно! Будьте внимательны при выборе плит, обращая внимание на клеевую основу, она должна быть безопасной!

Таблица физико-механических характеристик ОСБ плит

Показатели	Стан- дарт	Aggloply OSB 2	Aggloply OSB 3	OSB 2			OSB 3
Толщина, мм		10-18	10-18	6-10	10-18	18-25	6-10
Допуск по толщине, мм: — плита нешлифованная — плита шлифованная	EN 324-1	0,3 0,3	0,3 0,3	±0,8 ±0,3			±0,8 ±0,3
Допуск по длине, мм	EN 324-1	3	3	3			3
Допуск по ширине, мм	EN 324-1	3	3	3			3
Прямоугольность, мм	EN 324-2	1,5	1,5	1,5			1,5
Прямолинейность, мм/1м	EN 324-1	2	2	2			2
Модуль упругости, Н/мм²: — продольная ось — поперечная ось	EN 310	>6000 >2500	>6000 >2500	3500 1400			3500 1400
Прочность на изгиб, Н/мм²: — продольная ось — поперечная ось	EN 310	>35 >17	>35 >17	22 11	20 10	18 9	22 11
Поперечное растяжение, Н/мм²	EN 310	>0,75	>0,75	0,34	0,32	0,3	0,34
Формальдегиды, мг/100г	EN 120	<6,5	<6,5	<8			<8
Разбухание за 24 ч при полном погружении в воду, %	EN 317	12	6	20			15

Размеры ОСБ плит

Данные листы обычно имеют толщину примерно 8-25 миллиметров. Таким образом, они распределяются на три подгруппы:

тонкие;
средние;
толстые.

Тонкая плита имеет толщину 8, 9 и 10 миллиметров. Средняя плита – 12 и 15 миллиметров, а толстая – 18, 22 и 25 миллиметров. Чем толще лист, тем больше весит плита. Плита толщиной 8 миллиметров будет весить 16,6 килограмм, 9 миллиметров – 18,4 килограмм, 10 миллиметров – 20,6 килограмм и так далее.

Больше всего пользуются популярностью листы с размерами 2440 на 1220 миллиметров. Их часто используют в строительных работах. По европейским стандартам популярным считается лист 2500 на 1250 миллиметров. Размер 2440 на 590 миллиметров встречается довольно редко и используется, в основном, для накрытия пола.

Таблица размеров ОСБ плит

Показатели	Плиты с ровными краями								Плиты со шпунтом
Размеры (дхш), мм	2440х1220, 2500х1250								2440х1220, 2440х590, 2450х590, 2500х1250
Толщина, мм	9	10	11	12	15	16	18	22	15	16	18	22
Количество листов в пакете, шт.	100	80	75	70	55	50	45	35	55	50	45	35

Как убрать ржавчину с металла: обзор способов

Расценки на кладку кирпича: технология, виды, приблизительные расчеты

Покраска ОСБ плит

Данные изделия отлично переносят всевозможные виды отделочных работ. Эти плиты можно смело покрывать краской, наносить на них лак, штукатурить, делать обшивку с помощью кирпичной кладки и многое другое.

Красить ОСБ плиты лучше всего масляной краской, но можно также использовать алкидные эмали, водоэмульсионку, всевозможные пропитки. Краски нужно осторожно брать с помощью кисточки и наносить на плиту. Также можно воспользоваться специальными валиками или пульверизаторами.

На изделия отлично наносятся клеевые массы и лакокрасочные растворы. Это даёт широкие возможности изменять плиты во внешнем виде и защитить их от воздействия влаги. По завершении работы над покраской плит можно покрыть изделие лаком, однако только при проведении внутренних работ, в случае наружных работ используют более серьезные методы.

Прежде, чем перейти к окраске плиты, поверхность нужно подготовить. Сначала нужно выполнить шлифовку с помощью наждачной бумаги. Это делается для того, чтобы грунтовка и краска не попали внутрь плиты. Затем рабочую зону в местах крепления нужно выровнять с помощью шпаклёвки. Высохшую шпаклёвку стоит зачистить шкуркой. После этого поверхность равномерно грунтуется акриловым или акрилово-полиуретановым водным лаком для дерева пропорцией 1:10. Можно для этого приобрести специальную грунтовку. Дальше плита окрашивается и сушится. При этом избегайте сквозняков и перепадов температур.

Расчет досок и бруса в одном кубометре — формулы, примеры расчетов, таблицы

Плотность кирпича

Ориентированно-стружечные плиты являются поистине качественным материалом современного строительства. Сейчас эти средства популярны в строительных работах, очень часто используются. На свою цену изделия действительно очень качественные и полностью её оправдывают. Среди тех людей, которые использовали данные плиты, практически не найдётся ни одного, который бы негативно о них отозвался. Листы ОСБ имеют огромное количество положительных характеристик, что делает их применение достаточно лёгким.

Для того, чтобы качественно облицевать объект с помощью этих плит, нужно с грамотностью подойти к их выбору, полностью изучить их разновидности и характеристики, чтобы потом не жалеть о покупке.

Эти листы считаются отличным решением для всех специалистов. Они позволяют создавать целые дома, используя технологию каркасов, идеальны для отделки стен, крыш, полов. Всё это делается с этими материалами в кратчайшее время. Жильё, выполненное с применением ОСБ плит, будет служить долговечно и обеспечит жильцам комфорт и уют.

Расход цемента на 1 куб бетона

Расход водоэмульсионной краски на 1м2

Сколько кирпичей в одном кубе (1м3): расчеты

Вес стали оцинкованной листовой: вычисления

Протокол отрицательного окрашивания электронного микроскопа при сыпи | Оспа

Загрузить: Протокол электронного микроскопа с отрицательным окрашиванием для сыпи Cdc-pdf[PDF – 10 страниц]

Введение

Электронно-микроскопическая (ЭМ) визуализация отрицательно окрашенных вирионов поксвируса была ценным методом для подтверждения инфекций поксвируса во время ликвидации оспы кампания. Исторически сложилось так, что отрицательное окрашивание ЭМ успешно выявляло частицы поксвируса примерно в 95% клинических образцов от пациентов с ортопоксвирусными инфекциями, такими как оспа (оспа)/обезьянья оспа, и примерно 65% от пациентов с коровьей оспой (вакцина против оспы). В случае преднамеренного высвобождения вируса оспы и последующего заболевания человека или при генерализованных инфекциях коровьей оспы, возникших в результате вакцинации, отрицательно окрашенные препараты, полученные из пораженных участков или струпьев, снова окажутся ценным методом, помогающим в диагностике поксвируса и/или исключении других причины сыпи болезни. Однако ЭМ-визуализация вирионов, совместимых с поксвирусом, сама по себе не является доказательством оспы, потому что различные поксвирусы, такие как вирусы натуральной оспы, коровьей оспы, обезьяньей оспы и моллюска (моллюскипоксвируса), морфологически неразличимы.

Хотя лаборатории ЭМ будут неотъемлемыми членами группы биоподготовки, необходимо рассмотреть несколько вопросов, прежде чем лаборатория ЭМ согласится обрабатывать образцы от пациентов с подозрением на поксвирусную инфекцию. В первую очередь следует учитывать диагностические возможности лабораторного персонала, который должен иметь опыт подготовки сеток ЭМ с отрицательным окрашиванием и, что более важно, должен иметь опыт анализа препаратов ЭМ с отрицательным окрашиванием для идентификации морфологии вируса и дифференциации их от двойников. и артефакты. Во-вторых, персонал ЭМ, который будет работать с образцами, должен быть недавно вакцинирован или не иметь противопоказаний к постконтактной вакцинации. Наконец, ЭМ-лаборатория должна иметь доступ к сдерживанию BSL-3 или к учреждению BSL-2, которое может использовать меры предосторожности BSL-3.

Лаборатории EM, занимающиеся вирусной диагностикой с отрицательным окрашиванием, приглашаются к участию в программе внешней оценки качества, проводимой Институтом Роберта Коха в Берлине. Тренинг называется «EQA-EMV (Внешняя схема обеспечения качества в электронно-микроскопической диагностике вирусов) — электронно-микроскопическая диагностика кольцевым тестом».

Отчетность и соответствующие действия

Клинические образцы, полученные до события, с высоким уровнем подозрения на наличие вируса натуральной оспы, как описано в Протоколе лечения острой, генерализованной везикулярной или пустулезной сыпи, должны быть немедленно отправлены в CDC для специализированной диагностической оценки . В CDC будет проведено несколько тестов для подтверждения или исключения заражения оспой, учитывая, что положительный результат на оспу ускорит немедленные и обширные ответные меры общественного здравоохранения.
Подробная информация доступна на домашней странице CDC по оспе.

Материалы

Приемлемые образцы из поражений

Везикулярная жидкость на ЭМ сетке
Везикулярная жидкость в виде мазков на предметных стеклах
Биопсия корок и тканей
Тампоны
Везикулярная жидкость в туберкулиновом шприце или другом собирательном устройстве

Эти устройства для сбора должны транспортироваться в герметичном пластиковом контейнере, чтобы избежать утечки. При использовании иглы и шприца необходимо соблюдать меры предосторожности. Проконсультируйтесь с местным офицером безопасности.

Реагенты

Фосфорно-вольфрамовая кислота (рецепт см. в разделе «Реагенты для окрашивания негативных красителей»)
Уранилацетат (см. рецепт в разделе «Реагенты для окрашивания негативных красителей»)
Стерильная деионизированная вода (dH ₂ O)
1% Alcian Blue (Sigma Aldrich)
2% параформальдегид класса EM (Electron Microscopy Sciences), забуференный фосфатно-солевым буфером (PBS, pH 7,3)
Свежеприготовленный коммерческий отбеливатель (гипохлорит натрия) в разведении 1:10

Расходные материалы

Медные сетки 400 меш с формваровым углеродным покрытием (Electron Microscopy Sciences) (на этих сетках блестящая сторона покрыта пластиком.)
Ящик для хранения сетки (Electron Microscopy Sciences)
Парафильм
Шприц 1 мл (для шага II. B.9.)
Шприцевые фильтры (для шага II.B.9.)
Набор пестиков и насадок для измельчения (Fisher Scientific)
Система пробирок для взятия мазков (Roche Applied Science)
Микроцентрифужные пробирки с уплотнительным кольцом
Марлевая подушечка, смоченная в свежеприготовленном растворе коммерческого отбеливателя 1:10
Дополнительно, для альтернативной подготовки мазков (см. шаг I.D.2.): конические центрифужные пробирки, пластиковые, 15 мл; Шприц, пластиковый, 3 мл; Деревянная палочка-аппликатор
При необходимости для УФ-облучения и инактивации отбеливателя (см. этап III.A.): чашки Петри, пластиковые, 60 х 15 мм и 100 х 15 мм; Бумага фильтровальная, круглая, 55 мм.

Оборудование

Трансмиссионный электронный микроскоп
Пинцет, класс EM (примеры: Ted Pella, Inc. и Electron Microscopy Sciences)
Микроцентрифуга (см. этап I.C.3.)
Настольная центрифуга (см. шаг I. D.2.(f))
Дополнительно, для концентрации вируса (см. шаг I.F.): Airfuge (Beckman Instruments)
Дополнительно, для альтернативной подготовки сетки (см. шаг II.A.2.): Блок тлеющего разряда и вакуумный насос (Ted Pella, Inc.). В качестве альтернативы, установка тлеющего разряда может быть сконструирована в лаборатории по схеме, описанной Эби и Поллардом (см. Ссылки).
При необходимости для УФ-облучения и инактивации отбеливателя (см. шаг III.A.): бактерицидные ультрафиолетовые лампы серии E, подставка для лампы, УФ-метр, УФ-очки (Spectroline)

Materials Sources

Beckman InstrumentsExternal Tel: (800) 742-2345

Electronic Microscopy SciencesExternal Tel: (800) 523-5874

Fisher ScientificExternal Tel: (800) 766-7000 Roche Applied ScienceExternal Tel: (800) 766-7000

03 Science ) 262-1640

Sigma-AldrichВнешний телефон: (800) 325-3010

SpectrolineExternal Тел.: (800) 274-8888

Ted Pella, Inc.Внешний тел. : (800) 237-3526

Отказ от ответственности:

Названия поставщиков или производителей приведены в качестве примеров подходящих источников продукции; включение не означает одобрения Центрами по контролю и профилактике заболеваний или Министерством здравоохранения и социальных служб.

Процедура отрицательного окрашивания

Реагенты для отрицательного окрашивания

2% фосфорно-вольфрамовая кислота (PTA):
- 2 г фосфорновольфрамовой кислоты в 100 мл dH ₂ 0
- рН до 7,0 с КОН
- Хранить при температуре от 2 до 8°C
0,5% ацетат уранила (UA):
- 0,5 г уранилацетата в 100 мл dH ₂ 0
- Оставить на ночь
- Хранить при температуре от 2 до 8°C в темном месте

Подготовка образцов
Со всеми незафиксированными материалами из образцов высокого риска следует работать в BSL-3.
Примечание. По возможности подготовьте не менее 2 сеток на образец. Если материал на ЭМ сетке слишком плотный, разбавьте образец dH ₂ O и сделайте новые сетки.

Везикулярная жидкость на сетках ЭМ, предварительно приготовленных методом прямого касания:
1. Перейдите к шагу II.B.9.
Везикулярная жидкость в виде мазков на предметных стеклах:
1. Добавить 1-2 капли стерильного dH ₂ 0.
2. Соскребите сухой материал для ресуспендирования.
3. Сделайте ЭМ сетки прямо из этого материала (см. шаг II.)
4. Перенесите оставшуюся жидкость в микроцентрифужную пробирку для хранения/дальнейшего тестирования.
Биопсия корок и тканей (используйте пестик и трубку-измельчитель):
1. Поместите корку в пробирку измельчителя тканей и добавьте 1 мл стерильного dH ₂ 0.
2. Измельчить до получения опалесцирующей суспензии.
3. Центрифуга при 1000 x г в течение 5 минут.
4. Используйте супернатант в качестве образца для этапа II.
Тампоны
1. Либо , следуйте указаниям для системы трубок для взятия тампонов (Roche)
2. или следуйте альтернативным процедурам (ниже):
  1. Поместите мазок в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую приблизительно 0,3 мл стерильного dH ₂ 0.
  2. Замочить на 10-15 минут.
  3. Деревянной палочкой-аппликатором соскребите остатки образца с ватного тампона прямо в dH ₂ 0.
  4. Временно удалите тампон из центрифужной пробирки. Поместите цилиндр только 3-кубового шприца в коническую пробирку объемом 15 мл, затем поместите тампон в цилиндр шприца. Отломить палку. Завинтить крышку для предотвращения аэрозолизации.
  5. Поместите коническую пробирку в канистру центрифуги с ротором с аэрозольным барьером.
  6. Центрифуга при 2000 x г в течение 20 минут.
  7. Поместите всю канистру центрифуги обратно в BSC. Снимите коническую трубку с канистры.
  8. Извлеките и выбросьте тампон и цилиндр шприца в мусорную корзину, содержащую коммерческий отбеливатель в разведении 1:10.
  9. Ресуспендируйте любой осадок. Используйте полученную жидкость в качестве образца для шага II.
Везикулярная жидкость в коллективных устройствах (например, шприце, капиллярной трубке и т. д.)
1. Вылейте жидкость в микроцентрифужную пробирку.
2. Поместите две капли образца от 2 до 5 мкл на лист парафильма. (Сохраните оставшуюся жидкость для дополнительных испытаний.)
3. Разбавьте каплю 2 ^nd, добавив равное количество dH ₂ 0 и перемешав.
4. Перейдите к шагу II.
5. Сохраните оставшийся образец в микроцентрифужной пробирке для хранения/дальнейшего тестирования.
Концентрация вируса (опционально):
1. Если возможно, для концентрирования вируса в образцах, полученных на этапе I. B.3, можно использовать аэрацию. (везикулярная жидкость в виде мазков на предметных стеклах), этап I.C.4. (корки и биопсии тканей) и шаг I.D.1. Или I.D.2.(i). (мазки).
2. Образцы центрифугируют при 30 фунтов/дюйм ² в течение 30 минут, сливают надосадочную жидкость в кювету для отходов, содержащую свежеразбавленный раствор хлорной извести, ресуспендируют осадок в 10–20 мкл dH ₂ 0 и используют жидкость в качестве образца для этапа II. .

Обработка сетки ЭМ методом «капля-капля»
По возможности сделайте как минимум 2 сетки образцов.
1. Повышение гидрофильности ЭМ сеток:
  1. Поместите сетки с пластиковым/углеродным покрытием (пластиковой стороной вниз) на каплю 1% Alcian Blue на 5 минут, затем промойте 3 каплями dH ₂ O.
  2. В качестве альтернативы, если возможно, используйте обработку тлеющим разрядом на сетках непосредственно перед нанесением сетки на каплю образца.
2. Drop-to-Drop (см. рис. 1):
  1. Поместите 5 мкл жидкого образца на лист парафильма.
  2. ПРИМЕЧАНИЕ. Во избежание перекрестного загрязнения используйте разные пинцеты для каждого образца.
  3. Поместите медную сетку 400 меш с пластиковым/углеродным покрытием (пластиковой стороной вниз) на каплю и дайте впитаться в течение 10 минут.
  4. Удалите лишнюю жидкость фильтровальной бумагой.
  5. Поместите сетку в большую каплю забуференного 2% параформальдегида на 5 минут.
  6. Удалите лишнюю жидкость фильтровальной бумагой.
  7. Ополаскиватель с 2 каплями dH ₂ O.
  8. Удалите лишнюю жидкость фильтровальной бумагой.
  9. Пятно.
    1. Красители можно хранить в шприцах объемом 1 мл, оснащенных шприцевыми фильтрами. Накрыть шприц с 0,5% УК фольгой для защиты от света.
    2. Поместите сетку (пластиковой стороной вниз) на каплю отфильтрованного 2% PTA, pH 7,0, и оставьте окрашиваться примерно на 30 секунд.
    3. Если имеются 2 сетки для образцов ^и, окрашивайте отфильтрованным 0,5% UA в течение приблизительно 30 секунд.
  10. Удалите лишнюю жидкость фильтровальной бумагой.
  11. Если вы переходите к шагу III.A., поместите сетки на дно пластиковой чашки Петри размером 60 x 15 мм, содержащей круглую фильтровальную бумагу. В противном случае перейдите к шагу III.B.

Рис. 1. Иллюстрация метода «капля-капля», описанная в разделе II.B, для предварительно зафиксированных образцов.
Адаптировано из FW Doane and N Anderson, Электронная микроскопия в диагностической вирусологии.

Деактивация
Примечание. Деактивируйте решетки в Кабинете биологической безопасности.
1. Инактивация УФ-излучением и хлорной известью (см. рис. 2)
  Примечание. Эти этапы с использованием УФ-облучения и хлорной извести необходимы только для образцов, которые были определены как представляющие высокий риск заражения вирусом натуральной оспы. (Пожалуйста, обратитесь к разделу «Диагностика и оценка» для получения дополнительной информации об оценке риска образцов.) Они используются для обеспечения инактивации любых вирусных частиц, в том числе на фильтровальной бумаге или снаружи чашки Петри.
  1. Добавьте свежеприготовленный коммерческий отбеливатель в разведении 1:10 в чашку Петри размером 100 x 15 мм, чтобы покрыть дно чашки (примерно 50 мл).
  2. Поместите дно чашки Петри для образцов (с сетками) в большую чашку.
  3. Поместить под УФ-свет (длина волны 254 нм) и облучать в течение 10 минут.
  4. Переверните сетки и облучайте еще 10 минут.

Рисунок 2: УФ-облучение и инактивация отбеливателем (см. этап III.A.). Изображение оборудования, описанного на этапе III.A, используемого для инактивации образцов с помощью УФ-облучения и инактивации отбеливателем.

1. Используя чистый пинцет , поместите сетки в ящик для хранения сеток. Внимательно запишите, какой слот используется для каждого образца пациента. Все использованные ЭМ-пинцеты должны быть продезинфицированы марлей, пропитанной раствором хлорной извести 1:10.

Интерпретация результатов

Поксвирусы, за исключением парапоксвирусов

Размер вирионов составляет примерно 225 X 300 нм, они выглядят прямоугольными или кирпичообразными при осмотре в продольном направлении и круглыми или овальными при осмотре сбоку. В зависимости от проникновения пятна можно увидеть две формы. У формы «М» (или «тутовой») поверхность покрыта короткими мутовчатыми нитями, а в центре вириона иногда видно круглое углубление. В частицах, пронизанных красителем, формы «С» или («капсульной») поверхностные филаменты не видны; вместо этого вирион состоит из четко очерченного плотного ядра, окруженного несколькими слоистыми зонами разной плотности. Кроме того, иногда встречаются оболочечные частицы.

Рисунок 3: ЭМ вируса коровьей оспы из культуры ткани (A). ЭМ вируса коровьей оспы из клинического образца (В). ЭМ вируса оспы обезьян из клинического образца (С). Обратите внимание, что в клинических образцах морфология может быть менее отчетливой, чем в образцах тканевых культур.

Рисунок 4: ЭМ вируса оспы птиц, образец культуры ткани, демонстрирующий 3 вириона с формой «C» (A). ЭМ танапоксвируса, клинический образец (вирион с оболочкой) (Б).

Парапоксвирусы (например, Orf)

Частицы парапоксвируса выглядят более яйцевидными, чем другие поксвирусы, а поверхностные нити имеют спиральное или крестообразное расположение. Размер частиц составляет примерно 150 X 200 нм.

Рис. 5. ЭМ парапоксвируса (вируса Orf) из культуры ткани (A) и клинического образца (B). Электронно-микроскопические изображения вируса парапокса из культуры ткани и клинического образца.

Вирусы герпеса (например, вирус ветряной оспы, вирусы простого герпеса типа 1 и типа 2)

Голый нуклеокапсид диаметром около 100 нм состоит из икосаэдра, образованного полыми капсомерами. Нуклеокапсиды, пропитанные красителем, могут иметь вид шестиугольника, окруженного полыми капсомерами. Оболочечные вирионы можно идентифицировать, когда краситель проникает через вирусную оболочку и очерчивает нуклеокапсид.

Рисунок 6: Два изображения частиц вируса герпеса из культуры ткани. Оболочечные вирионы (А). Голые нуклеокапсиды, окруженные полыми капсомерами (В).

Рис. 7. Два изображения вируса герпеса из клинических образцов. Герпесвирус из клинических образцов. Обратите внимание, что в клинических образцах морфология может быть менее отчетливой, чем в образцах тканевых культур.
Обратите внимание, что в клинических образцах морфология может быть менее четкой, чем в образцах тканевых культур.

Меланосомы

Необходимо соблюдать осторожность, чтобы отличить частицы поксвируса от этой похожей структуры, обнаруживаемой в нормальной коже. Меланосомы находятся в эпидермисе кожи и волосяных луковицах и имеют диаметр около 370 нм и длину от 0,7 до 1,15 мкм.

Рис. 8: Два ЭМ-изображения меланосом.

Ссылки

Abei U и Pollard TD . Устройство тлеющего разряда для придания гидрофильности электронно-микроскопическим сеткам и другим поверхностям. Внешний вид. Журнал методов электронной микроскопии. 1987;7:29-33.

Центры по контролю и профилактике заболеваний. Оспа.

Gelderblom HR и Hazelton PR. Сбор препаратов для электронной микроскопииCdc-pdfExternal. Новые инфекционные заболевания. 2000;6(4):433-434.

Long GW, Nobel J, Murphy FA, Herrmann KL и Lourie B. Опыт использования электронной микроскопии в дифференциальной диагностике внешней оспы. Прикладная микробиология. 1970;20(3):497-504.

Миллер SE. Биотерроризм и электронно-микроскопическая дифференциация поксвирусов от герпесвирусов: можно и нельзя внешний. Ультраструктурная патология. 2003; 27:133-140.

Накано Дж.Х. Поксвирусы. Леннетт Э. Х. и Шмидт Н. Дж. , редакторы. Диагностические процедуры при вирусных, риккетсиозных и хламидийных инфекциях, 5 ^-е изд. Вашингтон, округ Колумбия: Американская ассоциация общественного здравоохранения . 1979; стр. 257-308.

Клинические заболевания | Оспа | CDC

Существует четыре основные клинические формы оспы, каждая со своими характеристиками. В эпоху оспы уровень летальности был разным для разных клинических форм, но в целом у непривитых лиц он составлял примерно 30%.

Обыкновенная оспа (Variola Major)

Обыкновенная оспа была наиболее распространенной формой, на нее приходилось более 85% всех случаев в эпоху оспы.

См. изображение обычной оспы ниже.

Инкубационный период

Заражение вирусом натуральной оспы начинается с инкубационного периода, обычно продолжающегося от 10 до 14 дней (от 7 до 19 дней). За это время у зараженного человека нет симптомов, он не заразен и может чувствовать себя нормально.

Продромальный период

Первые симптомы продромального периода начинаются после инкубационного периода и включают:

Лихорадку от 101°F до 105°F (от 38,3°C до 40,5°C)
Болезнь
Прострация
Головная боль
Боль в спине
Рвота
Сильная боль в животе
Озноб
Анорексия
Фарингит

Эта фаза длится около 4 дней. У пациентов с бледной кожей может быть видна эритематозная сыпь или редко петехиальная сыпь.

Эруптивная стадия

По мере снижения температуры начинают появляться высыпания. Поражения обычно появляются сначала на ротоглотке, затем на лице и конечностях, а затем распространяются на туловище, ладони и подошвы по центробежному типу распространения.

Поражения развиваются равномерно на протяжении всего заболевания и прогрессируют от пятен до папул и везикул в течение 4–5 дней. В течение следующих 1-2 дней везикулы часто пупкообразные и превращаются в пустулы, которые округлые, напряженные, твердые на ощупь и глубоко сидят в дерме. Поражения обычно демонстрируют одну и ту же стадию развития в любой области тела в любой момент времени.

Образование корок и струпьев обычно начинается на девятый день экзантемы. Корочки отпадают примерно через 14 дней после появления сыпи.

См. изображение Эруптивной стадии ниже.

Последствия

Оспины и рубцы являются наиболее частыми последствиями. Они являются следствием вирусопосредованного некроза и разрушения сальных желез. Рубцы могут возникать по всему телу, но наиболее обильны они на лице, где сосредоточено наибольшее количество сальных желез.

Другие последствия включают:

Слепота является редким явлением и возникает в результате рубцевания роговицы после кератита или изъязвления роговицы. Как правило, это происходит при наличии недоедания и/или оппортунистической инфекции.
Энцефалит
Остеомиелит
Мертворождения и самопроизвольные аборты
Бесплодие (обструктивная азооспермия) у мужчин

Выздоровление от оспы дает пациенту длительный иммунитет к повторному заражению вирусом натуральной оспы. Вирус не сохраняется в организме после выздоровления.

См. изображение последствий ниже.

Оспа модифицированного типа

Оспа модифицированного типа возникает у ранее вакцинированных лиц. При этом типе продромальная стадия может по-прежнему состоять из сильной головной боли, болей в спине и лихорадки и может длиться так же долго, как и при обычном типе. Однако, как только появляются кожные поражения, они обычно развиваются быстрее, и образование корочек заканчивается в течение 10 дней, в отличие от 14 дней при обычной оспе. Также может быть меньше поверхностных поражений, чем при обычной оспе. Пациенты также не склонны к лихорадке во время развития сыпи.

См. изображение оспы модифицированного типа ниже.

Плоская (злокачественная) оспа

Плоская или злокачественная оспа встречается очень редко и характеризуется выраженной токсемией. Чаще встречается у детей. В отличие от обычной оспы кожные поражения при этом типе развиваются медленно, сливаются между собой, остаются плоскими и мягкими (часто описываются как «бархатистые» на ощупь). Они никогда не прогрессируют до пустулезной стадии.

Внешний вид поражений свидетельствует о недостаточном клеточном иммунном ответе на вирус натуральной оспы, и большинство случаев плоской оспы заканчиваются летальным исходом. Если пациент выживает, поражения постепенно исчезают, не образуя струпьев. Предварительная вакцинация защищает от оспы плоского типа.

См. изображение плоской (злокачественной) оспы ниже.

Геморрагическая оспа

Геморрагическая оспа встречается в любом возрасте и у обоих полов, но чаще у взрослых. Беременные женщины кажутся более восприимчивыми. Основные биологические причины этого типа неясны. Предварительная вакцинация не защищает. Этот тип отличается от обыкновенной оспы:

Более коротким инкубационным периодом
Более тяжелые продромальные симптомы с высокой температурой, сильной головной болью и болью в животе
Развитие темной эритемы после начала заболевания с последующими петехиями и кровоизлияниями в кожу и слизистые оболочки

Смерть обычно наступает на 5 90 250 90 251 или 6 90 250 90 251 день появления сыпи, часто до появления характерных очагов оспы. Смерть наступает в результате глубокой токсемии, приводящей к полиорганной недостаточности.

См. изображение геморрагической оспы ниже.

Мужчина, больной оспой, с поражениями на верхней части туловища, руках, лице и шее. Источник: Барбара Райс из CDC.

Ноги больного оспой модифицированного типа. В характере их распределения наблюдается «обрезка» поражений. Сыпь напоминает ветряную оспу. Источник: доктор Робинсон из CDC.

Очаги оспы на туловище пациента в Бангладеш в 1973 году. Источник: Джеймс Хикс из CDC.

Женщина с плоской оспой на 6-й день сыпи. На изображении видны крепоподобные поражения на руках, кистях, шее и лице. Источник: Феннер Ф., Хендерсон Д.А., Арита И., Ежек З., Ладный И.Д. Оспа и ее искоренение. Женева, Швейцария: Всемирная организация здравоохранения; 1988 (стр. 33).

У этой матери и ребенка остались шрамы после перенесенной оспы. Рубцы соответствуют характеру распространения оспы. Источник: Стэнли О. Фостер из CDC.

Оспа позднего геморрагического типа у молодой женщины с кровотечением в основании пустул и развитием общего геморрагического диатеза на поздних стадиях заболевания (Источник: Herrlich A, Mayr A, Munz E, Rodenwaldt E. (1967). Die Poken; Erreger, Epidemiologie und klinisches Bild, 2-е изд., Штутгарт, Тиме.)

Характеристика двух исторических образцов оспы из Чешского музея

Вирусы. 2017 авг; 9 (8): 200.

Опубликовано онлайн 2017 г. 27 июля. DOI: 10.3390/V00

, ¹, ¹, ¹, ¹, ¹, ^{1 ^{1250125012501250125012501550125012501250125012501250155015501550155015555501, ¹, ¹. , ² , ³ , ³ , ⁴ , ⁴ , ⁴ , ⁵ , ⁶ , ⁶ , ⁷ , ⁸ , ⁸, ⁹, ¹⁰, ¹¹ и ^11, ^*}}

ERIC O. Freed, Academic Editor

Информация о сообщении. Статья о сочетании и лицензии

. оспа известна на протяжении столетий, самые старые доступные штаммы вируса натуральной оспы были выделены в начале 1940-х годов. В то время большие регионы мира уже были свободны от оспы. Следовательно, генетическая информация этих штаммов может представлять лишь самую последнюю часть длительного эволюционного процесса. На основе геномов 48 штаммов дифференцируются две клады: клада 1 включает варианты большой оспы, а клада 2 включает штаммы западноафриканской и малой оспы (Аластрим). Недавно был определен геном почти 400-летней литовской мумии, которая легла в основу всех секвенированных в настоящее время штаммов вируса натуральной оспы на филогенетических деревьях. Здесь мы определили два полных генома вируса натуральной оспы из тканей человека, хранящихся в музее в Праге, возраст которых составляет 60 и 160 лет соответственно. Кроме того, были проведены протеомные, химические и микроскопические исследования на основе масс-спектрометрии. Образец 60-летней давности, скорее всего, был завезен из Индии, страны, где в то время была эндемична оспа. Геном 160-летнего образца связан со штаммами клады 2 западноафриканской и малой натуральной оспы. Эта последовательность, вероятно, представляет новый эндемичный европейский вариант вируса натуральной оспы, циркулировавший в середине 19 века.го века в Европе.
Ключевые слова: оспа, вирус натуральной оспы, эволюция, секвенирование следующего поколения, исторический образец, филогения Оспа – одна из самых разрушительных болезней, известных человечеству. Характерные кожные высыпания, обнаруженные на египетских мумиях, а также древние медицинские записи указывают на его появление еще в 1100–1500 годах до нашей эры. Описания появляются в 4 веке нашей эры в Китае, в 7 веке нашей эры в Индии и Средиземноморье и в 10 веке нашей эры в юго-западной Азии. К середине 18 века оспа распространилась по всему миру [1]. Считается, что только в ХХ веке от оспы погибло 300 млн человек [2]. В 1980, более чем через 200 лет после начала первой кампании вакцинации, оспа была объявлена ликвидированной. Сегодня разрешенные Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) репозитории живых вирусов натуральной оспы хранятся только в двух сотрудничающих центрах ВОЗ: Центрах по контролю и профилактике заболеваний, Атланта, Соединенные Штаты Америки, и Государственном научно-исследовательском центре вирусологии и биотехнологии «ВЕКТОР». лаборатория, Новосибирск, Российская Федерация. Тем не менее, оспа по-прежнему остается одной из самых страшных биологических угроз, потому что сегодня большинство человечества иммунологически наивно; любая вспышка станет крупной катастрофой для общественного здравоохранения глобального масштаба [3].
Набор из 47 VARV, представляющих максимально возможное географическое и временное разнообразие, был выбран из репозитория ВОЗ в Атланте и секвенирован [4]. В результате анализа последовательности возникли две основные клады. Клада P-I включает азиатские и африканские изоляты; клада P-II состоит из двух субкладов, один из которых включает биологически отличающиеся южноамериканские изоляты, известные как Alastrim minor, характеризующиеся заметно низким уровнем летальности, а другой субклад состоит из штаммов, выделенных в Западной Африке. Западноафриканские VARV имеют относительно недавнего общего предка с Alastrim minor. Внутри клады VARV группируются в соответствии с их географическим происхождением [4]. Это неудивительно, поскольку оспа передается при тесном контакте между людьми, что приводит к довольно медленному распространению. Эпидемиологические, а также генетические исследования ясно показывают убедительные доказательства того, что все известные европейские VARV связаны с завозом из Азии или Африки и, таким образом, не представляют собой истинно эндемичных «европейских» штаммов.
Поскольку все 47 секвенированных геномов были выделены между 1944 и 1977 годами, что означает очень короткий период в историческом масштабе, трудно получить объективную оценку временных параметров молекулярной эволюции VARV. Исследовательские группы, используя архивные данные о вспышках оспы в сочетании с филогенетическим анализом, получили противоречивые результаты о возможном времени появления VARV [5,6,7] в зависимости от используемого метода. Щелкунов и др. [5,8] пришли к выводу, что VARV, скорее всего, отделился от вирусоподобного агента коровьей оспы за 3000–4000 лет до настоящего времени (YBP). Оспа стала эндемичной в Западной Африке в 14 веке нашей эры и начала распространяться в этом географически изолированном регионе. Приблизительно 300–400 YBP западноафриканский вариант VARV, завезенный в Южную Америку, начал развиваться в южноамериканский подтип VARV Alastrim.
Напротив, Li et al. [7] предположили, что две клады отделились от предкового вируса грызунов либо через 16 000, либо через 68 000 YBP. Клада PI распространилась из Азии либо 400, либо 1600 лет назад. Клада P-II отделилась от предковой VARV либо 1400, либо 6300 лет назад, а затем еще больше разошлась на два субклада, по крайней мере, 800 лет назад. Таким образом, дивергенция аластрима и натуральной оспы произошла раньше, чем это было установлено Щелкуновым [9].
Недавно был реконструирован проект генома VARV, взятый из литовской детской мумии, датируемой между 1643 и 1665 годами [10]. Поразительно, но последовательность мумии оказалась базовой для всех секвенированных в настоящее время штаммов VARV на филогенетических деревьях. Анализ молекулярных часов показал, что временная шкала эволюции оспы более поздняя, чем предполагалось, при этом диверсификация основных вирусных линий произошла только в 18-м и 19-м веках.вв. Ни один из анализов не объясняет, откуда происходят западноафриканские VARV.
Несколько образцов с подозрением на оспу (струпья и целые трупы), всплывших на поверхность после ликвидации, были исследованы, но не выявили последовательности VARV, полезные для филогенетического анализа [11,12,13,14,15]. Были амплифицированы только очень короткие последовательности от ребенка (139 п.н.) и от 300-летней сибирской мумии (718 п.н.) [11,15,16]. Здесь мы определили два полных генома VARV из тканей человека, хранящихся в музее в Праге 60 и 160 лет соответственно. Наши результаты показывают, что вирус VARV, циркулирующий в середине 19го века в Европе имеет общего предка с западноафриканскими и малыми штаммами натуральной оспы.
2.1. Диагностические препараты
В хранилище Чешского национального музея (Прага) в 2014 г. были обнаружены четыре сохранившиеся ткани с пометкой «Variola», однако документация об истории образцов отсутствовала [17]. Образец V563 состоит из интактного предплечья и передней части стопы ребенка, на обоих из которых четко видно генерализованное экзантематозное заболевание. Образец V1588 состоит из ок. Кусок кожи размером 10 × 10 см, покрытый многочисленными дискретными пупкообразными оспами. Оба образца визуально очень подозрительны на оспу (). Напротив, третий образец, V1589., был неправильно помечен, так как это, по-видимому, опухоль кожи, а другой образец, AJ572, хранился в растворе на основе формальдегида, попытки извлечь геномную ДНК полностью провалились. Поэтому для дальнейшего исследования были выбраны образцы В1588 и В563.
Открыть в отдельном окне
Анатомические препараты V1588 и V563 с маркировкой «Вариола», Чешский национальный музей, Прага.
2.2. Микроскопия
Поскольку ткани были погружены в раствор неизвестного состава, срезы образцов несколько раз промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), забуференным формальдегидом, перед обработкой для гистологии гематоксилина и эозина (H&E) в соответствии со стандартными процедурами. Для электронно-микроскопических исследований небольшие части образца переносили в фиксатор Макдауэлла и Трампа 4F:1G (Sigma-Aldrich, Тауфкирхен, Германия) на 19 часов.дней (3 смены) и промывали в PBS pH 7,2 в течение 7 дней (4 смены). Проводили постфиксацию в 2% OsO ₄ (Polysciences, Hirschberg, Germany) в том же буфере в течение 2 часов. Затем образцы тканей обезвоживали в градуированной серии спирта (30–100%), разбавляли 5% водным раствором уранилацетата (Polysciences), обезвоживали в пропиленоксиде (Sigma-Aldrich) и заливали в смолу Durcupan ACM (Sigma-Aldrich). Олдрич). Ультратонкие срезы (толщиной 70 нм), полученные с помощью алмазных ножей в микротоме Reichert Ultra Cut (Reichert, Вена, Австрия), собирали на медные сетки (300 меш) (Sigma-Aldrich). Сетки окрашивали 2% водным уранилацетатом и просматривали при 80 кВ с помощью микроскопа Jeol JEM, 2000 CX (Аришима, Токио, Япония), оснащенного цифровой камерой Olympus Megaview II (Olympus Europa SE & Co, Гамбург, Германия).
2.3. Экстракция ДНК и ПЦР-анализ
Небольшие кусочки образцов V1588 и V563 диаметром до 3 мм кратковременно промывали в PBS и инкубировали в лизирующем буфере (0,25 М ЭДТА, 1% ДСН, 1 мг/мл протеиназы К) в течение 24 ч при 55°С. Добавляли гликоген (20 мкг) и экстрагировали ДНК, используя фенол-хлороформ. После осаждения этанолом осадок ДНК промывали 80% этанолом, сушили и ресуспендировали в 10 мкл мМ Трис-Cl/1 мМ ЭДТА (рН 8,3). ДНК анализировали с использованием флуориметра Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific, Дармштадт, Германия) и 2% агарозного геля по стандартным протоколам. Один мкл использовали в качестве матрицы в двух ПЦР в реальном времени, нацеленных на последовательности гена слитого белка массой 14 кДа и гена модификатора цитокинового ответа B соответственно [18,19].] и в стандартном ПЦР-анализе последовательностей гена гемагглютинина [20].
2.4. Оценка возраста образцов и состава фиксирующего раствора
Для определения возраста образцов анализировали степень рацемизации d-, l-аспарагиновой кислоты, как описано ранее [21]. Вкратце, из каждого образца собирали приблизительно 2 мг ткани и выпаривали досуха. Добавляли смесь изопропанола и ацетилхлорида (4:1, 100 мкл) и нагревали до 100°С в течение 30 мин. Образцы выпаривали досуха в токе кислорода. Добавляли смесь дихлорметана и ангидрида трифторуксусной кислоты (1:1, 100 мкл) и нагревали до 60°С в течение 15 мин. Образцы снова выпаривали досуха. Оставшийся материал растворяли в 100 мкл метилацетата и анализировали с помощью газовой хроматографии. Соотношение d- и l-аспарагиновой кислот определяли как отношение площадей соответствующих пиков. В качестве положительного контроля использовали смесь d- и l-аспарагиновых кислот (1:10, Sigma). Десять образцов тканей известного возраста из хранилища Национального музея были выбраны в качестве калибровочных контролей. Химический состав растворов фиксаторов образцов В1588 и В563 определяли методами газовой хроматографии и атомно-абсорбционной спектрометрии (см. Приложение А).
2.5. Анализ секвенирования следующего поколения и филогенетический анализ
ДНК образцов V1588 и V563 подвергали секвенированию следующего поколения (NGS) после контроля качества ДНК с использованием биоанализатора Agilent (Agilent Technologies, Вальдброн, Германия). Для секвенирования была выбрана платформа HiSeq Illumina в сочетании с библиотекой парных концов размером 2 × 150 п.н. с использованием химии подготовки образцов TrueSeq Nano DNA LT (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США). Прочтения были вычтены из фона путем картирования хромосом человека с использованием BWA-MEM [22]. Несопоставленные считывания использовались для сборки контигов de novo после «понижения дискретизации» примерно до 150-кратной глубины покрытия. Для исправления ошибок применялись два различных подхода: CLC Genomic Workbench (CLC) и программное обеспечение SPAdes [23] с использованием Pilon [24]. BWA-MEM и пакет Samtools [25] использовали для определения вариантов по сравнению со штаммом VARV-IND53_ndel({«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»DQ441428″,»term_id» :»94486065″,»term_text»:»DQ441428″}}DQ441428). Консенсус-последовательности были извлечены с помощью обоих программных конвейеров, упомянутых выше, и различия были повторно оценены путем ручной проверки необработанной сборки. Для филогенетического анализа MAFFT-выравнивание [26] из всех 48 доступных геномов вируса VARV (таблица S1) были сгенерированы и оценены с использованием MEGA 6.0 [27].Кроме того, чтения «мумического» генома VARV VD21 (PRJNA348754) были загружены и обработаны в равной степени для наших образцов, как и его последовательность генома в открытом доступе не публиковалась, аннотацию штаммов VARV проводили с помощью GATU-utility [28]9.0003
2.6. Оценка молекулярных часов
Для оценки самых недавних общих предков (MRCA) для всех штаммов была выделена высококонсервативная область генома, расположенная в середине генома ортопоксвируса. Он включает все гены между геном F12L , геном, кодирующим актиновый хвост, и A32L , упаковочным белком АТФаза-ДНК. Согласно Upton et al. 2003 [29], известно, что эта область длиной 104 142 п.н. высококонсервативна примерно в 19 из 21 генома. Используя пакет BEAST [30], метод байесовской цепи Маркова Монте-Карло (MCMC) был использован для оценки MRCA и времени его разделения, а также филогенетических деревьев на основе рассчитанного выравнивания. Используя модель Юла для расчета априорного дерева, предполагалась постоянная скорость видообразования для каждой линии. Согласно Бабкину [5], эта модель была выбрана, поскольку в их исследовании было рассчитано, что она наилучшим образом подходит для такого рода отбора и оценки.
Использовалась некоррелированная модель расслабленных часов [31] в сочетании с моделью замещения Хасэгава-Кишино-Яно (HKY) [32] и моделью с фиксированной датой. Верхние даты года выделения были установлены для штаммов ВД21, В1588 и В563 на 1685 [10], 1850 и 1942 соответственно. Последние даты были выбраны в соответствии с результатами определения соотношения d-, l-аспарагиновой кислоты для определения возраста.
Двадцать миллионов шагов цепей MCMC были запущены для обеспечения сходимости, для чего первоначальные 10% цепей использовались в качестве прижигания и впоследствии отбрасывались. С помощью Tree Annotator пакета BEAST [30] в качестве хронограммы было выбрано дерево с максимальной суммой апостериорных вероятностей после прижигающих экспериментов и определено предполагаемое время разделения для V563 и V1588.
2.7. Масс-спектрометрия высокого разрешения
Протеомы двух исторических образцов были определены с помощью масс-спектрометрии высокого разрешения. Из-за потенциально мешающих веществ в супернатанте был применен рабочий процесс подготовки проб, основанный на подготовке проб с помощью фильтра (FASP) [33]. Расщепленные образцы анализировали с помощью нецелевой масс-спектрометрии на Q-Exactive (Thermo Fisher Scientific, Бремен, Германия) с использованием источника Nanospray Flex (Thermo Fisher Scientific). Спектральная библиотека МС/МС была создана с использованием программного обеспечения Skyline [34] и выбора суррогатных пептидов, включая их синтетические аналоги с тяжелой меткой и переходы. Наконец, все образцы были проанализированы с помощью целевой масс-спектрометрии с использованием 4000 QTRAP и 5500 QTRAP (AB Sciex, Дармштадт, Германия). Подробное описание рабочего процесса доступно в дополнительных материалах и методах S1.
3.1. Диагностические образцы и микроскопия
В двух из четырех образцов с пометкой «Variola», собранных в Чешском национальном музее в Праге, была обнаружена экзантематозная сыпь с дискретными и сливающимися поражениями, характерными для оспы (). H&E-окрашивание было субоптимальным, предположительно из-за возраста образца, хотя были обнаружены морфологические особенности, такие как образование внутриэпидермальных пузырьков (пустул), вздутие базальных кератиноцитов и кариорексис, а также интрацитоплазматические включения и элементарные тельца, которые согласуются с кожное оспинное поражение, вызванное вирусом оспы (данные не показаны). Исследование с помощью электронной микроскопии показало большое количество типичных частиц ортопоксвируса диаметром до 250–300 нм (1).
Открыть в отдельном окне
Электронная микроскопия образца V563 показывает большое количество типичных частиц ортопоксвируса при различном увеличении. Масштабные полосы соответствуют 2 микрометрам ( слева ) и 200 нм ( справа ).
3.2. Обнаружение ДНК вируса натуральной оспы
ДНК, выделенная из образцов, была сильно фрагментирована и деградировала, средний размер фрагмента составлял около 100–150 п.н. (V563) и около 200 п.н. (V1588) соответственно (). Два анализа ПЦР в реальном времени, амплифицирующие последовательности crmB и ген слитого белка давали VARV-положительные сигналы. Специфичность была достигнута за счет использования VARV-специфического зонда [18] и использования гибридизационных зондов с последующим анализом кривой плавления [19]. На основании значений C _t было определено, что количество копий VARV составляет около 25 000 на анализ. Напротив, ортопоксвирус-специфический ПЦР-анализ, амплифицирующий около 1000 п.н. гена гемагглютинина [20], был отрицательным с использованием матричной ДНК V563 или V1588 соответственно (данные не показаны).
Открыть в отдельном окне
Электрофорез в агарозном геле ДНК, окрашенной бромистым этидием, выделенной из образца V563.
3.3. Возраст образцов и состав фиксирующего раствора
Возраст образцов, измеренный по степени рацемизации Asp, оценивается в 62 ± 15 лет назад для V563, что при 2 стандартных отклонениях соответствует 1939–1969 гг. В случае V1588 возраст был определен как 167 ± 40 YBP, что при 2 SD соответствует 1809–1889 гг. Н.э. соответственно. Результаты анализа, включающего двадцать образцов с известным возрастом, использованных для калибровки, суммированы (рисунок S2 и таблица S2). Раствор фиксатора/консерванта, в котором хранились образцы, не содержал формальдегида. В случае V563 это был водный раствор с 2% натрия и 35% глицерина. В случае V1588 он содержал 1% натрия, 25% глицерина и 2,5% этанола (таблица S3).
3.4. Масс-спектрометрия высокого разрешения
Используя полученную спектральную библиотеку МС/МС, был разработан и повторно применен к образцам V563 и V1588 целевой метод масс-спектрометрии, включающий 7 пептидов 7 различных белков (и Таблица S3). Клетки почки африканской зеленой обезьяны MA104, инфицированные штаммами вируса коровьей оспы EP-4 lidil и BR VR302, штамм вируса коровьей оспы Elstree B5, штамм вируса оспы верблюдов CP-1 и ложно инфицированные клетки MA104 использовали в качестве контроля и анализировали параллельно. На основании масс-спектрометрического анализа ложно инфицированные клетки MA104 не содержали ни одного из выбранных белков/пептидов, что подтверждает их надежность в качестве отрицательного контроля. Экстракты, содержащие образцы, инфицированные вирусами коровьей оспы, коровьей оспы и оспы верблюдов, содержали 6 из 7 пептидов (за исключением пептида NDDVLFR, специфичного для VARV), что доказывает их пригодность в качестве материалов, не связанных с VARV-ортопоксвирусом. Наоборот, образцы V563 и V1588 содержали все 7 пептидов (1). Последовательность пептида NDDVLFR, входящего в состав слитого белка массой 14 кДа, специфична для VARV и может использоваться в качестве дискриминационного маркера.
Открыть в отдельном окне
Масс-спектрометрический (МС) протеомный анализ. ( A ) Репрезентативный спектр МС/МС пептида, специфичного для вируса натуральной оспы (NDDVLFR) из образца V1588. Спектр отображает интенсивность (ось y ) анализируемых отношений массы к заряду идентифицированных пептидных фрагментов (ось х ). На основании этого спектра фрагменты y4, y5 и y6 были задействованы в методике мониторинга выбранных реакций (SRM). ( B ) Хроматограмма Selected Reaction Monitoring пептида (NDDVLFR) образца V563. Пептидный гидролизат (обозначен красным) анализировали с добавленным синтетическим аналогом с тяжелой меткой (обозначен синим цветом). Наличие обоих пиков при времени удерживания 14,4 мин (на основе предшествующего анализа тяжелых пептидов) вместе с постоянством интенсивностей ионных пар является однозначным свидетельством присутствия пептида (NDDVLFR).
Таблица 1
Список специфических белков, пептидов, пептидов и их аминокислотных последовательностей, специфичных для ортопоксвирусов и вирусов натуральной оспы.
Protein Name Protein ID Peptide Specificity
VLFT-4 viral late transcription factor OS Q0N822_VARV ISAVSTVLEDVQAAGISR Orthopoxvirus
ORF1L (Fragment ) Q89160_VARV YQSLIPRLGINYLIDTTSR Orthopoxvirus
Core protein VP8 VP8_VAR67 SmLSIFNIVPR Orthopoxvirus
14 kDa protein K7ZBW7_VARV NDDVLFR Variola virus
Cowpox Белок включения типа А Q0NBD3_VARV VLLLTPEVASLR Ортопоксвирус
Late transcription factor 1 VLTF1_VAR67 VNVFETR Orthopoxvirus
Cowpox A-type inclusion protein Q0NBD3_VARV ISDLER Orthopoxvirus
Open in a separate window
3.
5. Секвенирование нового поколения и филогенетический анализ
Секвенирование ДНК образцов V563 и V1588 на платформе Illumina дало около 400 и 87 миллионов прочтений соответственно. Из них 4,3% и 12,3% соответственно были идентифицированы как поксвирус-специфические. Консенсусная последовательность вируса была собрана для обоих образцов, составляющих 183 535 п.н. (V563) и 184 287 п.н. (V1588) с теоретически рассчитанной средней глубиной покрытия в 1700 раз (V563) и 6900-кратный (V1588) (рисунок S3). Среднее содержание гуанина-цитозина (GC) было рассчитано как 33,3% (V563) и 32,8% (V1588). Обе последовательности содержали все аннотированные гены, найденные в эталонной последовательности VARV {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«текст»:»X69198″,»term_id»:»456758″,»term_text»:»X69198 «}}X69198 (таблица S1). Мы идентифицировали и подтвердили в общей сложности 34 (V563) и 405 (V1588) однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) относительно эталонной последовательности VARV-IND. Почти весь геном был успешно секвенирован, за исключением инвертированных терминальных повторов на самых дальних концах генома. Здесь надежная последовательность может быть получена только для последних 75 и 79п.н. NR2 (согласно Massung et al. [35]) из V1588 и V563 соответственно. Первой открытой рамкой считывания для обеих последовательностей является ген crmB .
Последовательности были отправлены в Европейский архив нуклеотидов (ENA) и им присвоены инвентарные номера {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LT706528″,»term_id»:»1226144057″,» term_text»:»LT706528″}}LT706528 (V563) и {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«текст»:»LT706529″,»term_id»:»1226144058″,»term_text»:» LT706529″}}LT706529(В1588). При выравнивании сиреневого цвета геномы не выявили серьезных перестроек по сравнению с эталонным геномом основного вируса натуральной оспы VARV-IND ({«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»DQ441427″,»term_id»: «94485863»,»term_text»:»DQ441427″}}DQ441427) и были сильно консервативны по содержанию и расположению генов со всеми другими VARV, выделенными в 20 веке [4,36].
Мы исследовали ген O1L , который, как считается, участвует в вирулентности и специфичности диапазона хозяев членов семейства Poxviridae [37]. Смитсон и др. [37] сравнили SNP, специфичные для вируса оспы Татера, вируса оспы верблюдов и VARV, с SNP, специфичными для всех других ортопоксвирусов, таких как коровья оспа, оспа обезьян и вирус мышиной оспы. В целом, все позиции SNP, определенные Smithson et al. также были обнаружены и подтверждены для образцов V563 и V1588 и были идентичны положениям SNP других штаммов VARV P1-клады. Кроме того, штаммы VD21 и V1588 показали некоторые дополнительные SNP: в положении 1029 (синонимичная мутация) VD21 показывает не относящийся к натуральной оспе кодон «ATC», тогда как кодон «ATT» можно найти во всех других секвенированных штаммах натуральной оспы. Эта мутация могла произойти до разделения линий VARV на P1 и P2-клады. В положении 1705 один SNP (GAT → AAT, D → N), не упомянутый Smithson et al. [37] и специфичных для штаммов P2-clade, включая V1588.
Филогенетический анализ V563 и V1588 с 48 полными геномами VARV, включая последовательность, полученную от 400-летней литовской мумии (таблица S2), показал, что V563 является членом клады P-I. Он наиболее тесно связан со штаммами VARV Harvey ({«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»DQ441444″,»term_id»:»94489293″,»term_text»:»DQ441444″ }}DQ441444) и Хинден ({«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«текст»:»DQ441445″,»term_id»:»94489496″,»term_text»:»DQ441445″}}DQ441445) отличается только 19и 14 SNP соответственно ().
Открыть в отдельном окне
Дерево максимальной достоверности для геномов вируса натуральной оспы, разделенное на основные клады P-I и P-II. Хронограмма была сгенерирована с использованием программного обеспечения BEAST и основана на высококонсервативной центральной области генома (104 142 п.н.). Апостериорные вероятности всех кладов составляют> 95%, если не указано иное вблизи узлов. Последовательности образцов V563 и V1588 показаны красным цветом.
Для получения генетической информации о географическом происхождении образцов человека, содержащих V563 и V1588, были секвенированы митохондриальные геномы каждого образца и определены их гаплотипы. Оба назначенных гаплотипа h2e (V563) и h2c (V1588) распространены по всей Европе. В то время как h2e встречается по всей Европе, h2c можно обнаружить особенно в Восточной Европе. Эти результаты согласуются с предположением, что эти образцы взяты у чешских пациентов.
3.6. Сравнение молекулярных часов
В отличие от расчетов, проведенных Duggan et al. [10], наш анализ молекулярных часов показывает, что VD21 имеет общего предка на 200 лет старше с VARV клады P1 и P2, датируемыми около 1350 г. н.э. (рис. S3). Этот результат был получен при включении в анализ возраста экземпляра V1588 (160 лет). Разделение в этом 14 веке привело нас к предположению, что VD21 принадлежал к отдельной и вымершей линии, но отличной от уже секвенированных штаммов P1 и P2 19 века.го и 20 века (рис. S3). Неопределенность в отношении даты разделения остается, но она может уменьшиться, когда в ближайшем будущем будут проанализированы дополнительные исторические образцы с хорошо задокументированными датами отбора проб.
Напротив, филогенетический анализ показал, что V1588 имеет довольно уникальную последовательность и наиболее тесно связан с кладой P-II; однако его нельзя было однозначно отнести ни к западноафриканскому, ни к малому субкладу натуральной оспы ().
Моделирование самого последнего общего предка определило время расхождения клад P-I и P-II примерно в 169 лет.5. Что касается нашего образца V1588, разделение между аластримской и западноафриканской кладами P-II могло произойти примерно в 1808 году нашей эры. Образец V563 показал сходную картину с более поздними штаммами P1. Однако анализ молекулярных часов показывает, что этот образец укоренился до разделения самых последних VARV, собранных в 1946 году и позже.
Авторы полностью осведомлены о том, что обращение с ДНК вируса натуральной оспы регулируется рядом рекомендаций Специального комитета ВОЗ по ортопоксвирусным инфекциям и Консультативного комитета ВОЗ по исследованиям вируса натуральной оспы (ACVVR). Разрешение на выполнение описанной здесь работы было предоставлено ACVVR, и мы проанализировали эти образцы с соблюдением максимальных мер предосторожности и в соответствии с согласованными на местном уровне национальными правилами. Чтобы исключить сохранение интактных вирусных частиц, был проведен ПЦР-анализ на большом расстоянии (приблизительно 1 т.п.о.). Положительных результатов получено не было, что свидетельствует об обширной фрагментации вирусного генома, что было подтверждено гель-электрофорезом с длиной фрагментов менее 200 п.н., что убедительно подтверждает предположение о том, что образцы не представляют никакой дальнейшей биологической угрозы. После проведения экспериментов все побочные продукты, содержащие ДНК вируса натуральной оспы, удаляли автоклавированием. Характерные поражения кожи, гистологические изменения, присутствие поксвирусных частиц и амплификация VARV-специфичной ДНК ясно доказывали, что образцы V563 и V1588 были получены от пациентов, инфицированных оспой. ПЦР в реальном времени дала довольно большое количество копий ДНК, специфичных для вируса VARV, в то время как стандартная ПЦР, амплифицирующая 1000 п.н. гена гемагглютинина, дала отрицательный результат. Это можно объяснить деградацией ДНК с течением времени, что приводит к размеру фрагментов от 50 до 200 п. н., что позволяет эффективно амплифицировать короткие ампликоны в ПЦР в реальном времени, но не позволяет амплифицировать более длинные последовательности. Поскольку размер фрагментированной ДНК (от 50 до 200 п.н.) идеально соответствовал диапазону, необходимому для подготовки эффективных библиотек для выполнения секвенирования следующего поколения, очень высокий охват (1700× и 6900×), и удалось собрать две высококачественные геномные последовательности. Этот успех в основном основан на том факте, что фиксирующие растворы образцов V563 и V1588 не содержали формальдегида, который обычно вызывает интенсивное сшивание и делает нуклеиновые кислоты полностью недоступными [38,39]. В предыдущем исследовании [15] при анализе ткани, десятилетиями хранившейся в растворе, содержащем формальдегид, методом ПЦР было получено лишь очень мало копий короткого ампликона (139 п.н.), что не позволило провести дальнейшую дифференциацию идентифицированного VARV [15].
Кроме того, мы продемонстрировали, что рабочий процесс масс-спектрометрии высокого разрешения может быть подходящим дополнительным подходом к анализу редких, труднодоступных или потенциально опасных агентов, таких как VARV. Что еще более важно, этот подход можно использовать для обнаружения VARV-специфических пептидов с высокой чувствительностью в нативном биологическом материале. Хотя жизнеспособные образцы, инфицированные VARV, более недоступны, материал, хранящийся в репозитории музея в Праге, оказался неоценимым в наших усилиях по проверке эффективности этого альтернативного аналитического метода.
Филогенетический анализ показал, что V563 является членом клады P-I и что он наиболее тесно связан со штаммами VARV Hinden и Harvey. Эти штаммы были завезены в Великобританию в 1946 и 1947 годах с Индийского субконтинента инфицированными путешественниками. В то время оспа уже была искоренена в европейских странах. Однако в период между 1930 и 1946 годами в Чехословакии было зарегистрировано 68 случаев оспы, все из которых были завезены из эндемичных районов Индии [3]. С предполагаемым возрастом 60 YBP весьма вероятно, что V563 был одним из 68 случаев, которые произошли в Чехословакии в течение 19 лет. 30 и 1946. К сожалению, медицинских записей об этих случаях оспы больше не существует, потому что архивы были уничтожены во время Второй мировой войны.
Возраст V1588 был откалиброван между 1800 и 1890 годами, периодом, когда оспа была эндемичной в европейских странах и унесла жизни тысяч людей, особенно после германо-французской войны 1870/71. Филогенетический анализ четко отнес V1588 к кладе P-2, которая разделена на субклады, состоящие из штаммов натуральной оспы и западноафриканских штаммов VARV. V1588 имеет общего предка с обоими субкладами, но ответвление является базальным для южноамериканских клад или клад Alastrim. Этот предок мог быть неизвестным до сих пор европейским прародителем. Существование генотипа Р-2 в Европе согласуется с филогенетическим анализом последовательности VARV (VD21) 400-летней литовской мумии, которая даже базальнее относится к кладам Р-1 и Р-2 [10]. ]. Заманчиво предположить, что американские штаммы VARV произошли от VD21 из-за прошлых европейских исследований, усилий по колонизации и иммиграции. Однако, поскольку образцы, происходящие из Америки, недоступны, невозможно доказать, были ли искоренены несколько более старых линий VARV в течение 19-го века.го и 20 века в Новом Свете.
Связь между западноафриканскими штаммами и европейским предком предполагает, что оспа могла быть завезена в густонаселенные районы Западной Африки европейскими работорговцами около 300–400 лет назад. Зараженные моряки или торговцы, возвращавшиеся из Западной Африки в континентальную Европу, могли занести эту родословную в Центральную Европу. Завоз этим путем в середине 19-го века может объяснить эпидемию оспы в Центральной Европе с незначительной, но все же смертельно вирулентной линией, подобной аластриму.
Внутри гена O1L последовательность V1588 отличалась одним нуклеотидом от V568 и VARV Бангладеш 1975 ({«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»DQ437581″,»term_id «:»109724243″,»term_text»:»DQ437581″}}DQ437581) в положении 1705. Этот ген был исследован Smithson et al. [37] в качестве эволюционного маркера диапазона хозяев и, следовательно, вирулентности. Если гипотеза о значении этих SNP для вирулентности действительно связана с коэффициентом летальности, можно утверждать, что этот SNP может быть одной из ответственных генетических детерминант за более низкую вирулентность или уровень инфицирования, чем у вируса натуральной оспы.
Изоляты VARV из Южной Америки и Западной Африки отличаются друг от друга, но объединены в общую ветвь (кладу P1), которая значительно отличается от всех других изолятов VARV из Африки/Азии (клада P2). Принимая это во внимание, в истории эволюции оспы остается загадкой понять, почему штаммы VARV принадлежат либо к кладе P1, либо к P2. Предполагалось, что западноафриканские варианты VARV были завезены в Южную Америку и впоследствии превратились в южноамериканские, то есть малые варианты натуральной оспы. Поскольку генетические данные штаммов VARV доступны только за самый последний и довольно короткий период до ликвидации, история эволюции оспы является предметом предположений. И действительно, существование двух клад и двух субкладов ставит много вопросов: откуда происходят западноафриканские изоляты VARV? Связаны ли они с европейскими вариантами VARV? Существует ли общий, может быть, европейский прародитель вирусов P1- и P2-клады? Какие изоляты VARV циркулировали в Европе, Америке и России? Каково отношение этих вымерших агентов к двум дифференцированным сегодня кладам? Возникала ли оспа неоднократно из предкового зоонозного вируса и исчезала ли из-за недостаточной плотности населения? На все эти вопросы можно ответить, только проанализировав исторические образцы с помощью новых технологий секвенирования, доступных сегодня, и в сочетании с надежными методами оценки возраста.
Авторы выражают благодарность Консультативному комитету Всемирной организации здравоохранения по исследованиям вируса натуральной оспы (ACVVR) за разрешение выполнить и опубликовать представленную здесь работу. Работа выполнена при финансовой поддержке проектов Министерства внутренних дел Чешской Республики (VF20152016039: База данных о типичных признаках биологических агентов — EBLN — Европейская сеть лабораторий биологической защиты) и (Vh30172020012: Подготовка коллекции биологически значимых токсинов при поддержке Европейского биологической европейской сети лабораторий биозащиты) и Министерством культуры Чешской Республики [DKRVO 2017/19, Национальный музей, 00023272).
Следующее доступно в Интернете по адресу www.mdpi.com/1999-4915/9/8/200/s1, рисунок S1: Модель линейной регрессии для оценки возраста исторических образцов на основе отношения d-/l- рацемизация асп; Рисунок S2: Схематическое изображение геномов, полученных из образцов V563 и V1588; Рисунок S3: Хронограмма дерева максимальной достоверности для вирусов натуральной оспы, созданного с использованием программного обеспечения BEAST на основе центральной консервативной области их геномов. Серые полосы в узлах представляют 95% интервалов с наивысшей плотностью вероятности. Числа на узлах указывают рассчитанный год самого последнего общего предка клад. Апостериорная вероятность всех клад составляет >95%, за исключением тех, которые помечены знаком «#» рядом с годом; Таблица S1: Штаммы вируса натуральной оспы, использованные для филогенетического анализа; Таблица S2: Соотношение измерений рацемизации d-, l-аспарагиновой кислоты; Таблица S3: Состав фиксирующих растворов; Таблица S4: Обзор переходов для протеомного целевого качественного анализа; Материалы и методы S1.
Щелкните здесь, чтобы просмотреть файл дополнительных данных. ^{(4.4M, zip)}
Растворы, в которых хранились образцы V563 и V1588, анализировали на наличие формальдегида, глицерина и камфоры с помощью газового хроматографа 6890N (Agilent Technologies) с автодозатором серии 7683 (Agilent Technologies). ), квадрупольный масс-спектрометр 5973 Inert (Agilent Technologies) и программное обеспечение MSD Chemstation Build 75 и Nist Mass Spectral Library v. 2.0g. Для анализа Ag, Cd, Cr, Cu, Na, Ni и Pb использовали быстрый последовательный атомно-абсорбционный спектрометр AA-240 FS для пламенной ААС и атомно-абсорбционный спектрометр Varian AA-240 Z Zeeman с распылителем с графитовой трубкой GTA (ETA AAS). применяемый. Содержание этанола определяли с помощью газовой хроматографии с использованием метода парофазного анализа на газовом хроматографе GC-2010 Plus с пламенно-ионизационным детектором (Shimadzu, Токио, Япония).
П.П. и Х.М. задумал и спроектировал эксперименты; П.П. и LP провели эксперименты на основе ДНК; JD, MH, JK, AF и RH провели эксперименты на основе белков; Х.К. и JP провели эксперименты по микроскопии; П.А., К.Ф., А.П., Р.К. и Дж.С. проведены химические анализы; Х.М., М.А., Д.Э., Т.Х., Т.Р. и AP проанализировали данные; В.К., П.В., В.Б. и П.Д. предоставленные реагенты/материалы/инструменты анализа; Х.М., М.А., П.П. и Д.Э. написал бумагу.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
1. Феннер Ф. , Хендерсон Д.А., Арита И., Езек З., Ладный И.Д. Оспа. Всемирный орган здравоохранения; Женева, Швейцария: 1988. [Google Scholar]
2. Геддес А.М. История оспы. клин. Дерматол. 2006; 24: 152–157. doi: 10.1016/j.clidermatol.2005.11.009. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
3. Хендерсон Д.А., Арита И. Угроза оспы: время пересмотреть глобальную политику. Биосекур. Биотеррор. биодеф. Стратег. Практика. науч. 2014;12:117–121. doi: 10.1089/bsp.2014.1509.комм. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
4. Эспозито Дж.Дж. Разнообразие последовательностей генома и ключи к разгадке эволюции вируса натуральной оспы. Наука. 2006; 313: 807–812. doi: 10.1126/science.1125134. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
5. Бабкин В.И., Бабкина Н.И. Ретроспективное исследование молекулярной эволюции ортопоксвируса. Заразить. Жене. Эвол. Дж. Мол. Эпидемиол. Эвол. Жене. Заразить. Дис. 2012;12:1597–1604. doi: 10.1016/j.meegid.2012.07.011. [PubMed] [CrossRef] [Академия Google]
6. Бабкин И.В., Непомнящих Т.С., Максютов Р.А., Гуторов В.В., Бабкина И.Н., Щелкунов С.Н. Сравнительный анализ вариабельных областей генома вируса натуральной оспы. Мол. биол. 2008; 42: 543–553. doi: 10.1134/S0026893308040092. [CrossRef] [Google Scholar]
7. Li Y., Carroll D.S., Gardner S.N., Walsh M.C., Vitalis E.A., Damon I.K. О происхождении оспы: корреляция филогенетики натуральной оспы с историческими записями по оспе. проц. Натл. акад. науч. США. 2007; 104:15787–15792. doi: 10.1073/pnas.0609268104. [Статья PMC free] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
8. Бабкин В.И., Щелкунов Н.С. [Молекулярная эволюция поксвирусов] Генетика. 2008;44:1029–1044. doi: 10.1134/S1022795408080036. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
9. Щелкунов С.Н. Как давно появился вирус оспы? Арка Вирол. 2009; 154: 1865–1871. doi: 10.1007/s00705-009-0536-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
10. Дагган А.Т., Пердомо М.Ф., Пьомбино-Маскали Д., Марциняк С., Пойнар Д., Эмери М.В., Бухманн Дж. П., Дюшен С., Янкаускас Р., Хамфрис М. ., и другие. Вирус натуральной оспы 17-го века раскрывает недавнюю историю оспы. Курс. биол. 2016;26:3407–3412. doi: 10.1016/j.cub.2016.10.061. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
11. Biagini P., Thèves C., Balaresque P., Géraut A., Cannet C., Keyser C., Nikolaeva D., Gérard P., Duchesne S., Orlando L., et al. Вирус натуральной оспы у 300-летней сибирской мумии. Н. англ. Дж. Мед. 2012;367:2057–2059. doi: 10.1056/NEJMc1208124. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
12. Enserink M., Stone R. Dead Virus Walking. Наука. 2002; 295:2001–2005. doi: 10.1126/science.295.5562.2001. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
13. Fornaciari G., Marchetti A. Неповрежденные частицы вируса оспы в итальянской мумии шестнадцатого века. Ланцет. 1986;328:625. doi: 10.1016/S0140-6736(86)92443-8. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
14. МакКоллум А.М., Ли Ю., Уилкинс К., Карем К.Л., Дэвидсон В.Б., Паддок К.Д., Рейнольдс М. Г., Дэймон И.К. Жизнеспособность и сигнатуры поксвируса в исторических реликвиях. Эмердж. Заразить. Дис. 2014;20:177–184. doi: 10.3201/eid2002.131098. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Обнаружение и идентификация вируса натуральной оспы в фиксированных тканях человека после длительного архивного хранения. лаборатория расследование 2004; 84: 41–48. doi: 10.1038/labinvest.3700008. [PubMed] [CrossRef] [Академия Google]
16. Тев С., Биаджини П., Кружези Э. Новое открытие оспы. клин. микробиол. Заразить. 2014;20:210–218. doi: 10.1111/1469-0691.12536. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
17. Смрчка В., Кужелка В., Повышил С. Атлас болезней сухих костей: верхние и нижние конечности. Академия; Прага, Чехия: 2009 г. Введение; стр. 15–33. [Google Scholar]
18. Феделе К.Г., Негредо А., Молеро Ф., Санчес-Секо М.П., Тенорио А. Использование амплификации генома в реальном времени с внутренним контролем для обнаружения вируса натуральной оспы и других ортопоксвирусов, заражающих людей. Дж. Клин. микробиол. 2006; 44:4464–4470. doi: 10.1128/JCM.00276-06. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
19. Олсон А.В., Лауэ Т., Лейкер Т.М., Бабкин В.И., Дростен С., Щелкунов Н.С., Нидриг М., Дэймон К.И., Мейер Х. Система ПЦР в реальном времени для обнаружения ортопоксвирусов и одновременной идентификации вируса оспы. Дж. Клин. микробиол. 2004; 42:1940–1946. doi: 10.1128/JCM.42.5.1940-1946.2004. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
20. Damaso C.R.A., Esposito J.J., Condit RC, Moussatché N. Новый поксвирус человека и крупного рогатого скота в штате Рио-де-Жанейро: вирус Cantagalo может происходить от бразильца Вакцина против оспы. Вирусология. 2000;277:439–449. doi: 10.1006/viro.2000.0603. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
21. Пилин А., Чабала Р., Пудил Ф., Бенцко В. Использование соотношения d-, l-аспарагиновой кислоты в декальцинированном коллагене человеческого дентина в качестве оценки Человеческий век. J. Криминалистика. 2001;46:1228–1231. doi: 10.1520/JFS15126J. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
22. Ли Х. Выравнивание считываний последовательностей, клонирования последовательностей и сборочных контигов с помощью BWA-MEM. Библиотека Корнельского университета; Итака, штат Нью-Йорк, США: 2013. ArXiv13033997 Q-Bio. [Академия Google]
23. Банкевич А., Нурк С., Антипов Д., Гуревич А.А., Дворкин М., Куликов С.А., Лесин М.В., Николенко И.С., Фам С., Пржибельский Д.А., и др. SPAdes: новый алгоритм сборки генома и его приложения для секвенирования отдельных клеток. Дж. Вычисл. биол. Дж. Вычисл. Мол. Клеточная биол. 2012; 19: 455–477. doi: 10.1089/cmb.2012.0021. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
24. Уокер Дж. Б., Абил Т., Ши Т., Прист М., Абуэльель А., Сактикумар С., Куомо А.С., Зенг К., Вортман Дж., Янг К.С., Эрл М.А. Пилон: интегрированный инструмент для комплексного обнаружения микробных вариантов и улучшения сборки генома. ПЛОС ОДИН. 2014;9doi: 10. 1371/journal.pone.0112963. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
25. Li H., Handsaker B., Wysoker A., Fennell T., Ruan J., Homer N., Marth G., Abecasis G. , Дурбин Р. Формат Sequence Alignment/Map и SAMtools. Биоинформатика. 2009;25:2078–2079. doi: 10.1093/биоинформатика/btp352. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
26. Katoh K., Standley D.M. MAFFT Multiple Sequence Alignment Software Version 7: Улучшения в производительности и удобстве использования. Мол. биол. Эвол. 2013;30:772–780. дои: 10.1093/молбев/mst010. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
27. Кумар С., Ней М., Дадли Дж., Тамура К. MEGA: ориентированное на биологов программное обеспечение для эволюционного анализа последовательностей ДНК и белков. Краткий. Биоинформ. 2008; 9: 299–306. doi: 10.1093/bib/bbn017. [Статья PMC бесплатно] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
28. Черепанов В., Элерс А., Аптон С. Утилита переноса аннотаций генома (GATU): быстрая аннотация вирусных геномов с использованием близкородственного эталонного генома. БМС Геном. 2006; 7:150. дои: 10.1186/1471-2164-7-150. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
29. Аптон С., Слэк С., Хантер А.Л., Элерс А., Ропер Р.Л. Ортологичные кластеры поксвирусов: к определению минимально необходимого генома поксвируса. Дж. Вирол. 2003; 77: 7590–7600. doi: 10.1128/ОВИ.77.13.7590-7600.2003. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
30. Драммонд А.Дж., Сучард М.А., Се Д., Рамбо А. Байесовская филогенетика с BEAUti и BEAST 1.7. Мол. биол. Эвол. 2012; 29:1969–1973. doi: 10.1093/molbev/mss075. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
31. Драммонд А.Дж., Хо С.Ю.В., Филлипс М.Дж., Рамбо А. Расслабленная филогенетика и датирование с уверенностью. PLoS биол. 2006;4:e88. doi: 10.1371/journal.pbio.0040088. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
32. Хасегава М., Кишино Х., Яно Т. Датировка расщепления человека и обезьяны с помощью молекулярных часов митохондриальной ДНК. Дж. Мол. Эвол. 1985; 22: 160–174. doi: 10.1007/BF02101694. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
33. Wiśniewski J.R., Zougman A., Mann M. Комбинация фракционирования на основе FASP и StageTip позволяет провести углубленный анализ протеома мембраны гиппокампа. Дж. Протеом Рез. 2009 г.;8:5674–5678. doi: 10.1021/pr8n. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
34. MacLean B., Tomazela D.M., Shulman N., Chambers M., Finney G.L., Frewen B., Kern R., Tabb D.L., Liebler D.C., MacCoss M.J. Skyline: Редактор документов с открытым исходным кодом для создания и анализа целевых экспериментов по протеомике. Биоинформ. Оксф. англ. 2010;26:966–968. doi: 10.1093/биоинформатика/btq054. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
35. Massung R.F., Knight J.C., Esposito J.J. Топография инвертированных терминальных повторов вируса оспы натуральной оспы. Вирусология. 1995;211:350–355. doi: 10.1006/viro.1995.1416. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
36. Лефковиц Э.

Protein Name	Protein ID	Peptide	Specificity
VLFT-4 viral late transcription factor OS	Q0N822_VARV	ISAVSTVLEDVQAAGISR	Orthopoxvirus
ORF1L (Fragment )	Q89160_VARV	YQSLIPRLGINYLIDTTSR	Orthopoxvirus
Core protein VP8	VP8_VAR67	SmLSIFNIVPR	Orthopoxvirus
14 kDa protein	K7ZBW7_VARV	NDDVLFR	Variola virus
Cowpox Белок включения типа А	Q0NBD3_VARV	VLLLTPEVASLR	Ортопоксвирус
Late transcription factor 1	VLTF1_VAR67	VNVFETR	Orthopoxvirus
Cowpox A-type inclusion protein	Q0NBD3_VARV	ISDLER	Orthopoxvirus